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紫外分光光度法是根据物质的吸收光谱来研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。紫外可见分光光度计是实验室普及率较高的一类光谱仪器。由于灵敏度高、选择性好、准确度高、适用浓度范围广，重要的是分析成本低、操作简便、快速。因此，长期在分析领域扮演很重要的角色。

紫外分光光度计可以在紫外可见光区任意选择不同波长的光。物质的吸收光谱就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。

由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量。

用途

• 检定物质，根据吸收光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长λ-max和摩尔吸收系数ε是检定物质的常用物理参数。这在药物分析上就有着很广泛的应用。在国内外的药典中，已将众多的药物紫外吸收光谱的最大吸收波长和吸收系数载入其中，为药物分析提供了很好的手段。

• 与标准物及标准图谱对照将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标 准谱图对照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。

• 比较最大吸收波长吸收系数的一致性。

• 纯度检验。

• 推测化合物的分子结构。

• 氢键强度的测定实验证明，不同的极性溶剂产生氢键的强度也不同，这可以利用紫外光谱来判断化合物在不同溶剂中氢键强度，以确定选择哪一种溶剂。

• 络合物组成及稳定常数的测定。

• 反应动力学研究。

• 在有机分析中的应用有机分析是一门研究有机化合物的分离、鉴别及组成结构测定的科学，它是在有机化学和分析化学的基础上发展起来的综合性学科。

使用注意事项

1、温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。可以引起机械部件的锈蚀，使金属镜面的光洁度下降，引起仪器机械部分的误差或性能下降；造成光学部件如光栅、反射镜、聚焦镜等的铝膜锈蚀，产生光能不足、杂散光、噪声等，甚至仪器停止工作，从而影响仪器寿命。维护保养时应定期加以校正。使用紫外分光光度计应具备四季恒湿的仪器室，配置恒温设备，特别是地处南方地区的实验室。

2、环境中的尘埃和腐蚀性气体亦可影响机械系统的灵活性，降低各种限位开关、按键、光电偶合器的可靠性，也是造成必须学部件铝膜锈蚀的原因之一。因此，使用紫外分光光度计必须定期清洁，保障环境和仪器室内卫生条件，做好防尘工作。

3、紫外分光光度计仪器使用一定周期后，内部会积累一定量的尘埃，最好由维修工程师或在工程师指导下定期开启仪器外罩对内部进行除尘工作，同时将各发热元件的散热器重新紧固，对光学盒的密封窗口进行清洁，必要时对光路进行校准，对机械部分进行清洁和必要的润滑，最后恢复原状，再进行一些必要的检测、调校与记录。

操作流程及校准方法

1、紫外可见分光光度计光度测量

• 在模式选择屏幕中选择＜1.Photometric光度＞选项，将显示参数配置屏幕；

• 用GOTOWL键设定测量波长；

• 按F2键设定进样控制；

• 按START/STOP键时，测量开始，显示测量屏幕；

• 如需做空白校正，应在测量前先设置空白样品，然后按AUTO-ZERO键，将测量值置为OABS(100%)。

2、紫外可见分光光度计校正

• 开机预热10分钟足矣；

• 放入黑块和标样(没有的自己配)，关闭盖子；

• 校0；

• 把灯光对着黑块，把透光度调0；

• 把灯光对标样，将吸光度调到100%。

3、参比溶液介绍

参比溶液又称空白溶液，测量时用作比较、不含被测物质但其基体尽可能与试样溶液相似的溶液。通常用参比溶液扫描的曲线应是一条平坦的直线，有时基体中，虽不含被测物质，但含有别的物质，这时必须保证其不影响测试。经常碰到的是试剂空白中含有被测物质，此时必须经过纯化将其除去，否则将影响测定结果。

4、紫外可见分光光度计使用注意事项

• 开机前应先预热15分钟，然后开机自检；

• 湿度要控制在75%左右，温度在5-30℃之间；

• 仪器要稳压电源，接地要好，并且避免阳光直接照射。

常见故障排除

1、光源部分

(1)故障：氘灯不亮

• 原因

氘灯寿命到期(此种原因几率最高)；

• 检查

灯丝电压、阳极电压均有，灯丝也可能未断(可看到灯丝发红)；

• 处置

更换氘灯。

(2)故障：钨灯不亮

• 原因

钨灯灯丝烧断(此种原因几率最高)；

• 检查

钨灯两端有工作电压，但灯不亮；取下钨灯用万用表电阻档检测。

• 处置

更换新钨灯。

(3)故障：钨灯不亮

• 原因

没有点灯电压；

• 检查

保险丝被熔断；

• 处置

更换保险丝(如更换后再次烧断则要检查供电电路)。

(4)故障：氘灯不亮

• 原因

氘灯起辉电路故障；

• 检查

氘灯在起辉的过程中，一般是灯丝先要预热数秒钟，然后灯的阳极与阴极间才可起辉放电，如果灯在起辉的开始瞬间灯内闪动一下或连续闪动，并且更换新的氘灯后依然如此，有可能是电路有故障，灯电流调整用的大功率晶体管损坏的几率大。

• 处置

需要专业人士修理。

2、信号部分

(1)故障：吸光值结果出现负值(常见)

• 原因

没做空白记忆、样品的吸光值小于空白参比液；

• 检查

将参比液与样品液调换位置便知；

• 处置

做空白记忆、调换参比液或用参比液配置样品溶液；

(2)故障：样品室内无任何物品的情况下全波长范围内基线噪声大

• 原因

光源镜位置不正确、石英窗表面被溅射上样品；

• 检查

观察光源是否照射到入射狭缝的中央，石英窗上有无污染物；

• 处置

重新调整光源镜的位置，用乙醇清洗石英窗；

(3)故障：信号的分辨率不够具体表现是本应叠加在某一大峰上的小峰无法观察到

• 原因

狭缝设置过窄而扫描速度过快，造成检测器响应速度跟不上，从而失去应测到的信号；按常理，一定的狭缝宽度要对应一定范围的扫描速度；或者狭缝设置得过宽，使仪器的分辨率下降，将小峰融合在大峰里了。

• 检查

放慢扫描速度看一看或将狭缝设窄；

• 处置

将扫描速度、狭缝宽窄、时间常数三者拟合成一个优化的条件；

(4)故障：样品室内无任何物品的情况下仅仅是紫外区的基线噪声大

• 原因

氘灯老化、光学系统的反光镜表面劣化、滤光片出现结晶物；

• 检查

可见区的基线较为平坦，断电后打开仪器的单色器及上盖，肉眼可以观察到光栅、反光镜表面有一层白色雾状物覆盖在上面；如果光学系统正常，可能是氘灯老化，可以通过能量检查或更换新灯方法加以判断；

• 处置

更换氘灯、用火棉胶粘取镜面上的污物或用研磨膏研磨滤光片(注意此种技巧需要有一定维修经验者来实施)；

(5)故障：样品出峰位置不对

• 原因

波长传动机构产生位移；

• 检查

通过氘灯的656.1nm的特征谱线来判断波长是否准确；

• 处置

对于高档仪器而言处理手段相对简单，使用仪器固有的自动校正功能即可；而对于相对简单的仪器，这种调整则需要专业人员来进行了；清洗比色皿，更换空白溶液。

(6)故障：样品信号重现性不良

• 原因

排除仪器本身的原因外，可能是样品溶液不均匀所致；在简易的单光束仪器中，样品池架一般为推拉式的，有时重复推拉不在同一个位置上；

• 检查

更换一种稳定的试样判定；

• 处置

采取正确的试样配置手段；修理推拉式样品架的定位碰珠；

(7)故障：做基线扫描或样品扫描时基线或信号有一个大的负脉冲

• 原因

扫描速度设置得过快，信号在读取时，误将滤光片或光源镜的切换当做信号读取了。

(8)故障：没有任何检测信号输出

• 原因

没有任何光束照射到样品室内；

• 检查

将波长设定为530nm，狭缝尽量开到最宽档位，在黑暗的环境下用一张白纸放在样品室光窗出口处，观察白纸上有无绿光斑影像；

• 处置

检查光源镜是否转到位，双光束仪器的切光电机是否转动了(耳朵可以听见电机转动的声音)；改变扫描速度。

(9)故障：做基线扫描或样品扫描时基线或信号有一个长时间段的负值或满屏大噪声

• 原因

滤光片饲服电机“失步”，造成档位错位，尤其是国产电机；

• 检查

重新开机有可能恢复，或打开单色器对照波长与滤光片的相对位置来检查(注意打开单色器时要保护检测器不被强光刺激)。

(10)故障：当仪器波长固定在某个波长下时吸光值信号上下摆动，特别是测量模式转换为按键开关式的简易仪器

• 原因

开关触点因长期氧化所致造成接触不良；

• 检查

用手加重力量按琴键时，吸光值随之变化；

• 处置

用金属活化剂清洗按键触点即可。

(11)故障：样品室放入空白后做基线记忆噪声较大，紫外区尤甚

• 原因

比色皿表面或内壁被污染、使用了玻璃比色皿或空白样品对紫外光谱的吸收太强烈，使放大器超出了校正范围；

• 检查

将波长设定为250nm，先在不放任何物品的状态下调零，然后将空比色皿插入样品道一侧，此时吸光值应小于0.07Abs；如果大于此值，有可能是比色皿不干净或使用了玻璃比色皿；同样方法也可判断空白溶液的吸光值大小；

• 处置

更换饲服电机。

(12)故障：仪器零点飘忽不定主要反映在简易仪器上

• 原因

在简易仪器中，零点往往是通过电位器来调整，这种电位器一般是炭膜电阻制作的，使用久了往往造成接触不良；

• 处置

更换电位器。

3、其他故障

(1)光门不能完全关闭

修复光门部件，使其完全关闭。

(2)透过率“100%”旋到底了

重新调整“100%”旋钮。

(3)仪器严重受潮

可打开光电管暗盒，用电吹风吹上一会儿使其干燥，并更换干燥剂。分析仪器工作者要懂得仪器的日常维护和对主要技术指标的简易测试方法，经常对仪器进行维护和测试，以保证仪器工作在理想状态。