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色谱法总论是什么？
色谱法，一种基于不同物质在固定相与流动相之间吸附或溶解能力差异的分离技术，广泛应用于化学、生物、医药等多个领域。
• 固定相
色谱分离过程中不移动的具有吸附活性的固体或是涂渍在载体表面的液体。
• 流动相
色谱分离过程中携带组分向前移动的物质。
在化学分析中用于混合物分离，生物领域用于生物大分子分离，在医药行业用于药物研发和质量控制。色谱法在化学、生物、医药等多个领域发挥着重要作用。在化学分析中常用于混合物的分离与纯化，在生物领域被广泛应用于生物大分子的分离与测定，而在医药领域更是成为了药物研发与质量控制的关键技术。
色谱法分离原理
当混合物随流动相流经色谱柱时，就会与柱中固定相发生作用(溶解、吸附等)，由于混合物中各组分物理化学性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小、强弱不同，在同一推动力作用下，各组分在固定相中的滞留时间不同，从而使混合物中各组分按一定顺序从柱中流出。这种利用各组分在两相中性能上的差异，使混合物中各组分分离的技术，称为色谱法。
色谱法的特点
• 分离效率高，复杂混合物，有机同系物、异构体；
• 灵敏度高，可以检测出μg•g-1(10-6)级甚至ng•g-1(10-9)级的物质量；
• 分析速度快，一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析；
• 应用范围广，气相色谱(沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析)；液相色谱(高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析)；
• 高选择性(对性质极为相似的组分有很强的分离能力)；不足之处是被分离组分的定性较为困难。
色谱法的分类
1、按两相状态分类
• 气相色谱(GasChromatography，GC)
流动相为气体(称为载气)，常用的气相色谱流动相有N2、H2、He等气体；按分离柱不同可分为填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为气固色谱和气液色谱。
• 液相色谱(Liquid Chromatography，LC)
流动相为液体(也称为淋洗液)；按固定相的不同分为液固色谱和液液色谱。
• 超临界流体色谱(Supercritical Fluid Chromatography，SFC)
流动相为超临界流体，是一种介于气体和液体之间的状态。超临界流体色谱法是集气相色谱法和液相色谱法的优势而发展起来的一种新型的色谱分离分析技术，不仅能够分析气相色谱不宜分析的高沸点、低挥发性的试样组分，而且具有比高效液相色谱更快的分析速率和更高的柱效率。
2、按分离机制分类
• 吸附色谱(Absorption chromatography)
基于物质在固体吸附剂表面吸附能力差异实现分离的分析方法，常用吸附剂包括硅胶、氧化铝、活性炭等。
• 分配色谱(Partition Chromatography)
基于物质在两相间分配系数差异实现分离的物理化学分析方法，其固定相为液体(如涂布或键合在硅胶、硅藻土等载体表面)，流动相为液体或气体。
• 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)
离子交换色谱中的固定相中的一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其它带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。
• 凝胶色谱(Gel Chromatography)
以凝胶为固定相的液-固色谱法，属于特殊的液相色谱。常用的凝胶有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、丙烯酰胺凝胶等，常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺和水等。
3、按操作形式分类
• 柱色谱(Column Chromatography，CC)
固定相装在柱管内，包括填充柱色谱和毛细管柱色谱。
• 纸色谱(Paper Chromatography, PC)
固定相为滤纸，采用适当溶剂使样品在滤纸上展开而进行分离。
• 薄层色谱(Thin Layer Chromatography, TLC)
固定相压成或涂成薄层，操作方法同纸色谱。
色谱法的核心知识点
• 色谱图
组分在检测器上产生的信号强度对时间(t)所作的图，由于它记录了各组分流出色谱柱的情况，所以又叫色谱流出曲线，流出曲线的突起部分称为色谱峰。
• 色谱保留值
色谱保留值是色谱定性分析的依据，它体现了各待测组分在色谱柱上的滞留情况。在固定相中溶解性能越好，或与固定相的吸附性能越强的组分，在柱中的滞留时间越长，或者说将组分带出色谱柱所需的流动相体积越大，所以保留值可用保留时间和保留体积两套参数来描述。
• 色谱图上的色谱流出曲线说明的问题
根据色谱峰的数目，可判断样品中所含组分的最少个数；根据色谱峰的保留值进行定性分析；根据色谱峰的面积或峰高进行定量分析；根据色谱峰的保留值和区域宽度评价色谱柱的分离效能；根据两峰间的距离，可评价固定相及流动相选择是否合适。
• 分配比
是指在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。
• 在色谱流出曲线上，两峰之间的距离主要由两组分在两相间的分配系数还是扩散速度决定？原因是什么？
是分配系数。两峰间的距离由热力学因素决定，两组分在两相中分配系数差异越大，两峰间的距离则相差越大越容易被分离。而扩散速度是动力学因素，反映在色谱流出曲线上即为色谱峰的区域宽度(形状)。
• 色谱理论需解决的问题
色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。
• 组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？
组分保留时间不同是因为色谱过程的热力学因素控制(组分和固定液的结构和性质)。色谱峰变宽的原因是色谱过程的动力学因素控制(两相中的运动阻力，扩散作用)。塔板理论和速率理论分别从热力学和动力学的角度阐述了色谱分离效能及其影响因素。
• 半经验理论
将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复(类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程)。
• 塔板理论的特点
塔板理论引入了塔板数和塔板高度作为柱效的衡量指标；不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时应指明测定物质；柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大都无法分离。
• 塔板理论的不足之处
塔板理论的基本假设不符合色谱柱的实际分离过程，其无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果，不能说明色谱峰为什么会展宽，同时未能指出影响柱效的因素及提高柱效的途径和方法。
• 速率方程(也称范第姆特方程式)
H=A+B/u+C•u，H塔板高度，u流动相的平均线速度(cm/s)。
(1)A─涡流扩散项
A与流动相性质、流动相速率无关。要减小A值，需从提高固定相的颗粒细度和均匀性及填充均匀性来解决。对于空心毛细管柱，A=0。固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑，表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。
(2)B/u—分子扩散项
存在着浓度差，产生纵向扩散;扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差；分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑；
(3)扩散系数
Dg∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。C•u—传质阻力项：dp↓，df↓，D↑,可降低传质阻力。
• H-u曲线与最佳流速
由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。
• 速率理论的要点
组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因；通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效；速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响；各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响。选择最佳条件才能使柱效达到最高。
• 色谱定性方法
(1)与标样对照的方法
①利用保留值定性
通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。
②利用加入法定性
将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。
(2)利用文献保留值定性
利用相对保留值r21定性。相对保留值r21仅与柱温和固定相性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定相上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。
• 色谱定量分析
(1)定量校正因子
试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即mi=fi’•Ai；
①绝对校正因子
比例系数fi；单位面积对应的物质量fI ’=mi/Ai，
②相对校正因子fi
即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。
(2)常用的几种定量方法
①归一化法
简便、准确，进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大，仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。
②外标法-标准曲线法
外标法不使用校正因子，准确性较高，操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。
③内标法
准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大；每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析；若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则wi=Ai/As*常数。
需满足以下要求：
(a)试样中不含有该物质；
(b)与被测组分性质比较接近；
(c)不与试样发生化学反应；
(d)出峰位置应位于被测组分附近，且能分离开；
(e)加入量适中并与待测组分接近。