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什么是色谱柱？

色谱法是一种分离混合物中各组分的分析技术。色谱柱是色谱中使用的仪器的一部分。使用柱的五种色谱方法是气相色谱(GC)、液相色谱(LC)、离子交换色谱(IEC)、尺寸排阻色谱(SEC)和手性色谱。色谱的基本原理可以应用于所有五种方法，其中，气相色谱柱和高效液相色谱柱是使用率高的两种方法。

• 气相色谱柱

在气相色谱中，流动相是气体。气相色谱柱的长度通常在1-100m之间。气相色谱法(GC)：液相固定相结合或吸附到毛细管柱的表面上，或结合到柱内填充的固体载体上。匹配分析物和固定相的极性两者具有相似的极性，固定相的厚度在0.1-8 µm之间，而厚度越厚，分析物的挥发性就越大。

• 高效液相色谱柱

高效液相色谱(HPLC)是液相色谱的一种。液相色谱柱共有三种基本类型：液-液、液-固和离子交换。液-液色谱柱不那么受欢迎，因为它们的稳定性有限且不方便。在液-固色谱柱中，固定相为固体，分析物吸收到固定相上，从而分析混合物的成分。通常，HPLC在分析柱之前有一个保护柱，以保护并延长分析柱的使用寿命。保护柱的作用是去除色谱柱上不可逆的颗粒物、污染物和分子等。

简言之，色谱柱是装填有固定相用以分离混合组分的柱管。多为金属或玻璃制作。有直管形、盘管形、U形管等形状。

色谱柱的分类

1、根据固定相极性的不同可分为极性色谱柱和非极性色谱柱；

2、根据固定相和流动相的相对极性的不同可分为正相色谱柱和反相色谱柱；

3、根据色谱柱填充剂的差别可分为硅胶柱、化学键合硅胶柱、离子交换树脂柱、凝胶柱、玻璃微球柱等。在化学键合硅胶柱中以十八烷基键合硅胶柱应用最广泛，辛基硅烷键合硅胶柱次之，即通常所说的C18和C8柱，胺基柱、腈基柱和苯基柱也偶有使用；

4、根据色谱柱内径的不同，液相色谱柱可分为微径柱、分析柱、快速柱、半制备柱、制备柱等，适用于不同的分离分析目的。常用的普通分析柱，内径通常为4.6mm(3/16in )，柱长15-25cm，填料粒径5-10pm，用于常规的分离分析。快速分析柱的内径一般为6mm或更大，柱长30-80mm，填料粒径为3pm或更小。半制备柱与制备柱，内径一般在6mm以上，用于半制备或制备目的。而微径柱内径一般为1mm，甚至有更小内径的毛细管柱，与常规分析柱相比，需要特殊的装填技术，并配合高精度的微流泵(nano pump)使用。

液相色谱通常均采用填充柱。色谱柱的分离效果取决于所选择的固定相，以及色谱柱的制备和操作条件。

简言之，常见的分配柱填料有：碳十八柱(ODS/C18)、碳八柱(Octy/C8)、碳六柱(Hexyl/C6)、碳四柱(Butyl/C4)、碳一注(Methyl/C1)、阴离子交换柱(SAX)、阳离子交换柱(SCX)、苯基柱(Phenyl)、氨基柱(Amino/NH2)、氰基柱(Cyano/CN/Nitrile)。常见的吸附柱填料：硅胶柱。

选择合适的色谱柱材料非常重要，因为它直接关系到分析分离的质量和速度。举例来讲，对于填充柱而言，可选择的固定相较多，柱容量较大，但是受柱长的限制，分离能力有限，主要应用于简单化合物的分离。

色谱柱分离材料的种类非常多，常见的有硅胶、C18、C8、C4、NH2等材料。硅胶是最早使用的分离材料之一，它可以完全分离很多杂质和杂质成分。其缺点是在酸性和碱性环境下易受损。C18是目前使用较广泛的分离材料之一，其特点是对疏水性的菲和芳香族化合物有很好的分离效果。C8、C4、NH2则以其适合分离的化合物不同而被应用。

不同的柱径和柱长也会影响分离效果。一般而言，柱径越小，分离效果越好；柱长越长，则分离时间越长，分离效果越好。分离效果与分辨率息息相关，分辨率即为两个峰的最近出峰时间点与两个峰高的平均宽度的比值。分辨率越高，两个成分之间的差异越明显，分离效果越好。

当然，除了色谱柱本身的选择和使用方法外，样品前处理过程的质量也是决定分离效果的关键因素之一。正确的样品前处理过程能够减少背景杂质的干扰，保证分离后的组分纯度。

色谱分离基本原理

在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，叫做固定相；另一相则不断流过固定相，叫做流动相。其分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。

高效液相色谱仪的分离原理

含有样品的流动相液体通过固定于柱子或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面；当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用，由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。

各色谱柱分离原理

1、反相色谱柱

分离原理：用键合非极性基团的载体填充而成的色谱柱，根据物质极性差异进行分离，固定相的极性小于流动相的极性。

适用范围：适用于大多数化合物,如蛋白质、肽、氨基酸、核酸、甾体、脂类、脂肪酸、糖类、生物碱等含有非极性基团的化合物。

常用色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、辛烷基硅烷键合硅胶(C8)、苯基键合硅胶、硅胶等。

2、正相色谱柱

分离原理：用硅胶或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱，根据物质极性差异进行分离。固定相的极性大于流动相的极性(也可使用含水流动相，HILIC)。

适用对象：适用于非极性至中等极性的中小分子化合物的分离，如脂溶性维生素、甾体激素等。

常用色谱柱：硅胶、氨基键合硅胶、氰基键合硅胶等。

3、离子交换色谱柱

分离原理：以离子交换树脂或化学键合离子交换剂为固定相，利用被分离组分离子交换能力的差别或选择系数的差别而实现分离。

适用对象：适用于离子或可离解的化合物，如无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素、蛋白质等。

常用色谱柱：有机共聚物树脂、硅胶微球离子交换剂、螯合树脂等。

4、分子排阻色谱柱

分离原理：根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系，对溶质进行分离，大分子的物质保留弱。

适用对象：用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖、聚乙烯、聚氯乙烯等。

常用色谱柱：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、苯乙烯Ｇ二乙烯基苯共聚物、高交联度苯乙烯Ｇ二乙烯基苯共聚物。

5、手性拆分色谱柱

分离原理： 由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其他聚合物上制成手性固定相，通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而实现光学异构体的拆分。

适用对象：光学异构体。

常用色谱柱：纤维素、环糊精、大环抗生素、蛋白质等。

不同色谱柱的清洗方法

高效液相色谱柱是消耗品，会随使用时间或进样的次数增加，出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰，柱效下降。需要定期进行清洗和再生，不同的色谱柱清洗方法各不相同。

• 反相柱

分别用甲醇:水=90:10，纯甲醇(HPLC级)，异丙醇(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)等溶剂作为流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积，然后再以相反的次序冲洗。

• 正相柱

分别用正己烷(HPLC级)，异丙醇(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)，甲醇(HPLC级)等溶剂做流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积(异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高)，注意使用溶剂的次序不要颠倒，用甲醇冲洗完后，再以相反的次序冲洗至正己烷，所有的流动相必须严格脱水。

• 离子交换柱

长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降，用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。

另外，还可以选择能溶解柱内污染物的溶剂为流动相做正方向和反方向冲洗。但再生后的色谱柱柱效是不可能恢复到新柱的水平的。如果柱子装反了，可以调回来，但可能会造成柱内担体塌陷，在不得已的情况下尽量不要反装色谱柱。